Chip/Co-IP/Chip-seq的準(zhǔn)備工作

更新時(shí)間：2023-03-07

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　　Chip/Co-IP/Chip-seq的準(zhǔn)備工作：

　　預(yù)冷PBS，RIPA Buffer，細(xì)胞刮子(用保鮮膜包好后，埋冰下)，離心機(jī)

　　1. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，后一次吸干PBS;

　　2. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1ml/107個(gè)細(xì)胞、10cm培養(yǎng)皿或150cm2培養(yǎng)瓶，0.5ml/5×106個(gè)細(xì)胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm2培養(yǎng)瓶)

　　3. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動(dòng)15min(EP管插冰上，置水平搖床上)

　　4. 4℃，14000g離心15min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中

　　5. 準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠

　　6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠(50%)，4℃搖晃10min(EP管插冰上，置水平搖床上)，以去除非特異性雜蛋白，降低背景

　　7. 4℃，14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除Protein A珠子

　　8. (Bradford 法)做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定蛋白濃度，測(cè)前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響(定量，分裝后，可以在-20℃保存一個(gè)月)

　　9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高(如10 μg/μl)

　　10. 加入體積的兔抗到500μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異

　　11. 4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育

　　12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl"過渡抗體"(兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG)

　　13. 14000rpm瞬時(shí)離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有時(shí)候會(huì)破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS

　　14. 用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定(60 μl足夠上三道)

　　15. 將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5min變性。

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