熒光原位雜交步驟

熒光原位雜交（FISH）實驗步驟

儀器設備
    1、 醫用微波爐；
     2、 水浴鍋；
     3、 OLYMPUS BX51熒光顯微鏡；
     4、 OLYMPUS DP11數字顯微照相機。

FISH試劑
    （1）1×PBS：由10×PBS溶液稀釋而成，儲存于4℃；
     （2）20×SSC（pH7.0）；
     （3）2×SSC，由20×SSC溶液稀釋而成；
     （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
     （5）變性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸餾水；28ml甲酰胺。每次新鮮配制。
     （6）雜交后洗滌液： 20×SSC 4ml；蒸餾水16ml；甲酰胺20ml。每次新鮮配制。調節pH前升至室溫。

實驗步驟
    1、脫蠟：
     1）二甲苯脫蠟3次，每次5min；
     2）100％酒精兩次，每次2min；
     3）移出酒精，斜置切片，標記末段向下，空氣干燥。
    2、蛋白酶處理:
     1）每個染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中預熱。將消化酶液加入管內，搖動直到酶溶解。
     2） 37℃水浴槽中預熱染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
     3） ×SSC在室溫下漂洗切片3次，每次1min。
     4）梯度酒精脫水（-20℃預冷）。
    3、變性：
     1）每一個立式染色缸配制40ml變性溶液；
     2）78℃水浴槽中平衡預熱混合液染色缸；
     3）78℃孵育8min；
     4） 即移入-20℃預冷70%酒精的染色缸內2min，再依次移入80%、90%和的-20℃預冷酒精內，每缸2min；
     5）空氣干燥。
    4、雜交：
     1）準備探針；
     2）取一個較大的濕盒，交叉放置切片；
     3）滴10μl探針在切片的組織上，加蓋玻片；
     4）蓋上濕盒蓋，37℃孵育12h～16h。
     雜交后的水洗：
     5）鑷子小心去除蓋玻片；
     6）43℃預熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min；
     7）2×SSC(37℃)洗兩次，每次10min；
     8）切片放人染色缸的1×PBS內待檢測，勿使切片干燥。
     檢測：
     9）從1×PBS中取出切片，除去過多的水分，避免標本干燥。把切片放入濕盒內，同時處理4張切片。
    
     11）去掉塑料蓋膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min。
擴增：
     12）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；
     13）每張切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；
     14）去掉塑料蓋膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min；
     15）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；
     16）每張切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；
     17）1×PBS室溫下洗3次，每次2min。
    5、細胞核染色：
     1）張切片加10μl～20μl DAPI，覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育2～5ml；
     2）盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h內可以在顯微鏡下觀察。

PRINS步驟
    1、常規脫蠟浸入0.01mol/LPBS；
    2、用0.2mol/L鹽酸處理5min；
    3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min；
    4、分別用80％，95％和100％酒精脫水，室溫干片；
    5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl，引物250ng，Taq DNA聚合酶2U)，加蓋片；
    6、94℃變性5min后置入65℃濕盒中5min；
    7、用0.1×SSC液，65℃洗5min；
    8、片于65℃ 10s～20s；用4×SSC-0.1％吐溫20液42℃洗5min，2次；
    9、經Buffer I液洗后滴加20％羊血清封閉30min；
    
    11、BufferⅢ液洗5min；
    12、用BCIP-NBT顯色1h～2h，在鏡下控制，終止顯色；
    13、用中性紅或核固紅襯染，酒精脫水，二甲苯透明，樹脂封片。