血小板疾病動物模型

小鼠血小板減少性紫癜模型

(1)復(fù)制方法  體重約為20g，年齡為8周齡的BALB/c小鼠。抗原制備：BALB/c小鼠經(jīng)乙丨醚麻醉后，眼球摘除取血(EDTA-Na2抗凝)，分離血小板并洗滌，用生理鹽水稀釋。免疫：取已準(zhǔn)備好的血小板分別與等量弗氏佐劑和不弗氏佐劑混合成油包水狀作為抗原。取含有弗氏佐劑的抗原于0周注射于豚鼠足掌、背及腹部皮下，每次至少4點(diǎn)，第5周豚鼠心臟取血(不抗凝)。560r/min，離心10min，取上清，得到豚鼠抗小鼠血小板血清(GP-APS)，-20℃保存。抗血清處理：將APS從冰箱取出，56℃水浴30min，用等量BALB/c小鼠紅細(xì)胞吸附至少2次，用生理鹽水稀釋成不同濃度APS備用。采用ELISA或者瓊脂擴(kuò)散法檢測抗血清的效價。于BALB/c小鼠腹腔內(nèi)注射抗血清(100μl)，造成小鼠一過性血小板減少。于注射抗血清后第1, 3, 5, 7, 9, 11, 13日分別經(jīng)小鼠腹腔注射已制備好的豚鼠抗小鼠血小板血清，每次100μl，使小鼠慢性持續(xù)血小板減少。于預(yù)定時間麻醉處死小鼠，取其脾臟、胸腺，腎上腺、股骨標(biāo)本經(jīng)固定液固定后，作常規(guī)組織切片，顯微鏡下觀察。

(2)模型特點(diǎn)  注射抗血清后模型小鼠可出現(xiàn)豎毛、便溏、體重減輕、精神萎靡、食耗量及飲水量均減少等癥狀。造模后24h起模型小鼠開始出現(xiàn)死亡，死亡小鼠可見其腹腔、腸道、尿道出血，后腹膜有大量出血點(diǎn)；造模后1～3d為小鼠死亡高峰時間。動物死亡及各種出血表現(xiàn)多見于注射抗血清后7d之內(nèi)。抗血小板血清注入模型小鼠體內(nèi)后，可引起血小板計(jì)數(shù)顯著減少。血小板相關(guān)抗體(PAIgG)升高。注射后6h小鼠脾臟重量開始增加，至第5日時脾重可為正常小鼠的3.6倍。注射抗血清后第6日脾臟巨核細(xì)胞開始明顯增多，至第15日時仍維持高水平，此后趨于正常；脾臟重量增加與巨核細(xì)胞增加明顯一致。鏡下病理組織學(xué)觀察顯示：造模后6h骨髓組織內(nèi)即可見巨核細(xì)胞增多，至第3日時達(dá)到高峰，直至22d仍高于正常小鼠。有1/4的模型小鼠可見胸腺、腎上腺皮質(zhì)萎縮。造模后小鼠出現(xiàn)明顯皮下紫癜，以注射部位(腹部)、陰丨囊、四肢、尾部為重。采用本方法(免疫法)建立的小鼠(或兔)的血小板減少性紫癜模型，制作原理簡單，操作方法較為復(fù)雜，干擾因素小，成本相對低廉。但其抗體為外源性的，需不斷補(bǔ)充輸注，維持慢性ITP穩(wěn)定性相對要差。效果優(yōu)于以往用ADP、馬利蘭、環(huán)磷酰胺或放射線照射等方法復(fù)制的血小板減少動物模型。雖然用ADP、馬利蘭、環(huán)磷酰胺等方法建立的模型也可引起血小板減少，但由于這些復(fù)制方法是通過損傷模型動物的骨髓造血干細(xì)胞，從而造成骨髓和外周血三系細(xì)胞均減少來復(fù)制血小板減少模型，其發(fā)病機(jī)制和臨床表現(xiàn)與ITP并不相同，在研究治療ITP新藥的藥效或藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，可直接影響對療效的判定。應(yīng)用本方法復(fù)制ITP動物模型的關(guān)鍵在于血小板抗原的純化，免疫途徑及方法可直接影響APS的效價。

(3)比較醫(yī)學(xué)  原發(fā)性血小板減少性紫癜是臨床上常見的出血性疾病，以機(jī)體外周血小板減少，骨髓巨核細(xì)胞增生伴成熟障礙為主要特征。由于從臨床患者的血液中可檢測出抗血小板抗體，因此又稱免疫性血小板減少性紫癜。其發(fā)病機(jī)制是由于同種抗體或自身抗體與血小板膜抗原結(jié)合，引起血小板破壞增多而發(fā)病。因此，血小板抗體的檢測在 ITP疾病的診斷和療效判定方面非常重要，本病的臨床治療以使用皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和脾切除為主，從遠(yuǎn)期療效看，大多數(shù)患者還不能獲得緩解。所以在基礎(chǔ)和臨床研究上都急需有突破性進(jìn)展，目前臨床上主要是側(cè)重PAIgG的研究。采用注射外源性抗體建立的慢性ITP動物模型，與臨床上人類ITP的患者表現(xiàn)出相似的特征。當(dāng)抗血小板血清注入模型動物體內(nèi)后，引起血小板計(jì)數(shù)顯著減少，PAIgG水平升高；注入的抗血清越多，PAIgG升高也越多，血小板減少程度越嚴(yán)重。同時模型動物的血小板壽命縮短，并伴有發(fā)熱、紫癜及止血障礙等。本模型對于人類ITP發(fā)病機(jī)制研究、抗血小板減少藥物的篩選有較大應(yīng)用價值。