自身免疫性內耳病動物模型

(1)復制方法  取4周齡近交系雄性C57BL/6小鼠，以及體重為300～400g，經檢查耳郭反射正常，無中耳感染的豚鼠。豚鼠麻醉后心臟灌注，斷頭取顳骨，在4℃無菌含1mg/L抑肽酶的10mmol/L Tris緩沖液中剝離全部內耳膜性組織，勻漿。勻漿液離心，取上清液-20℃凍存；沉淀在含0.5％十二烷基硫酸鈉、0.5％β-巰基乙醇、1％甘油、2mmol/ L苯甲丨基丨磺丨酰丨氟、10mmol/L N-己基順丁烯二甲亞胺的50mmol/L Tris緩沖液中勻漿，計算蛋白含量，-80℃分裝凍存。用制備的內耳抗原(Inner Ear Antigen, IEAg)免疫小鼠，每只模型小鼠頸背部皮下多點注射IEAg弗氏佐劑(Complete Freund Adjuvant, CFA)乳劑，足背皮內注射百日咳減毒活菌50μl(含25×1000000000個菌體)，IEAg含量為100μg。免疫后作小鼠雙側耳聽性腦干反應(auditory brainstem response, ABR)測試：動物麻醉后置聲、電屏蔽室內，采用誘發電位儀測試。取刺激聲0.1ms為短聲，間隔時間為50ms，濾波100～3000Hz，掃描時間為10ms，疊加500次。低于刺激聲30dB的白噪聲對側耳作掩蔽。以波Ⅱ的反應閾為標準判斷ABR的反應閾。分別在造模后7、14、21、28d檢測動物血清中抗IEAg抗體，并取顳骨組織，制作內耳組織常規切片，HE染色后，光鏡下觀察。

(2)模型特點  經IEAg免疫后2周內模型動物體重呈進行性下降，免疫3周后體重可恢復至免疫前水平，并緩慢增加；動物尚可出現活動減少、耳廓反射不敏感、走路不穩等臨床表現。造模前C57BL/6小鼠ABR反應閾均值為46dB SPL，左、右耳無顯著性差異；造模后第7日動物ABR反應閾即顯著提高。模型動物鏡下病理組織學觀察顯示，內耳組織中鼓階、蝸管、前庭階及蝸軸血管周圍有較多炎癥細胞浸潤，造模后前2周可見較多內淋巴積水；并可見螺旋神經節細胞腫脹及壞死樣改變，細胞數量在免疫后進行性減少。本模型應用豚鼠IEAg造模后，且模型動物聽力改變與細胞浸潤程度及血清抗IEAg抗體水平呈顯著性正相關，提示免疫和體液反應在誘發自身免疫性內耳病(autoimmune inner ear disease, AIED)時可能起重要作用。

(3)比較醫學  自身免疫性內耳病在臨床上目前仍然發病機制不明，也無特異性實驗室檢查指標，且治療原則存在爭議、治療效果不理想。建立與臨床AIED相似的疾病動物模型，有助于闡明自身免疫性內耳病的發病機制及分析內耳的免疫調節治療效果。以往的研究報道大多數實驗性 AIED均以遠交系豚鼠作為實驗動物，采用初次系統免疫后多次加強免疫的方式，通過機體產生的自身抗體經體液免疫介導免疫反應而誘發。這些模型成功率較低(20％～50％)；聽力損害程度較輕(8～25dB)；內耳病理改變不典型；多次加強免疫的實驗周期較長，增加了實驗中不確定因素對實驗結果的影響。由于遠交系動物在可重復性及免疫學分析的細節研究方面均較近交系動物差，所以這些模型并不能準確反映人類AIED的發病機制以及病理生理改變。本模型采用內耳抗原免疫動物后出現顯著的聽力下降，聽力損害程度隨免疫進程而不斷加劇，血清中可檢測到抗內耳組織的自身抗體，這些變化與臨床上AIED患者的表現一致；形態學上表現的血管周圍炎等特征性自身免疫性損害可進一步證實。 C57BL/6小鼠作為一種廣泛使用的近交系小鼠，其個體間極為一致，且對實驗反應也一致，可以消除雜合遺傳背景對實驗結果的影響。C57BL/6小鼠隨年齡增加可表現出與高頻相關的老年性聽力下降，因此這種動物模型被用于研究老年性耳聾。采用本方法誘導的AIED模型，具有發病率高，聽力損害程度嚴重，內耳病理改變典型，造模周期短，制作方法簡便，實驗條件比較簡單，其他因素容易控制的優點。